2007-10-03 | 軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克隆) 

將1.2％低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合制備0.6％的底層瓊脂，6 孔板中每個(gè)孔1.4ml 溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000 個(gè)/ml，將0.6％低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合，制備0.3％的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul 單細(xì)胞懸液（約1000cell/well)，混勻，室溫凝固。置于37℃，5％CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2－3 周，計(jì)數(shù)含50 個(gè)細(xì)胞以上得克隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，SpotII 采集圖像。
2007-10-03 | MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖及見解 

細(xì)胞以每孔3000個(gè)接種**96孔板，分成不同組，每組3孔，利用含有10％ 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h之后，向培養(yǎng)液中加入一定工作濃度的藥物（單體或混合物），繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48h。培養(yǎng)結(jié)束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小時(shí)（應(yīng)常在顯微鏡下觀察）。去除培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100μl，充分振蕩3分鐘，立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm的吸光度值。
由于這種方法基于琥珀酸脫氫酶的活性，因而加入MTT之后應(yīng)該在顯微鏡下觀察，藥物是否可以改變細(xì)胞琥珀酸脫氫酶的活性。若是改變則不可以使用此種方法。
另有根據(jù)細(xì)胞ATP含量測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，但是都要考慮藥物對(duì)細(xì)胞ATP是否有影響。
所以測(cè)定細(xì)胞增殖，**簡(jiǎn)單，**原始，**麻煩的方法，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)我們感覺還是**好的方法。
細(xì)胞培養(yǎng)方法
哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)則：
1，  嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)室規(guī)則進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞，由于細(xì)胞為整合生物中心共用，使用緊張，在使用時(shí)盡可能提高速度，保證操作規(guī)范。
2，  使用細(xì)胞間之后，主動(dòng)將安全柜臺(tái)面和桌面等清理整齊干凈。
3，  在自己培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)污染之時(shí)，及時(shí)通報(bào)同一培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞者，并將培養(yǎng)相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)液/PBS/胰酶等全部清出細(xì)胞培養(yǎng)室，以減輕對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。
4，  實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞培養(yǎng)原則要求：A，細(xì)胞復(fù)蘇之后兩代開始使用；B，保證細(xì)胞每次傳代前密度不超過90%；C，細(xì)胞使用**多12代（約2個(gè)月）。
5，  **好每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，若有異常及時(shí)處理。
6，  具體參照www.atcc.org中細(xì)胞培養(yǎng)要求。
 
細(xì)胞傳代方法
1，  將長(zhǎng)**80-90%細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。
2，  加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。
3，  瓶口用瓶蓋蓋好，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓   形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入適當(dāng)體積的培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1—3分鐘。根據(jù)不同細(xì)胞而異。
4，  用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，盡可能的避免氣泡產(chǎn)生，分到另外兩到三瓶中，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。
5，  細(xì)胞培養(yǎng)液參照www.atcc.org，一般含有10%胎牛或小牛血清。
96/24孔板傳代：
1，  前同于普通細(xì)胞傳代方法。
2，  細(xì)胞吹打均勻后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)需要調(diào)**適當(dāng)濃度。例如：每孔傳代10000個(gè)細(xì)胞，可以將細(xì)胞調(diào)**濃度十萬，之后利用排槍，吸取100ul，**96孔板中。
3，  24孔板，采用1ml移液器進(jìn)行傳代。
 
細(xì)胞凍存方法
 
1，  預(yù)先配制凍存液：含90%FBS，10%DMSO的凍存液，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；
2，  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×10⁶ ～ 5 ×10⁶細(xì)胞/ml)；
3，  加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱/冷凍日期/操作者。
4，  放于程序降溫盒，之后在-80℃冰箱過夜。
5，  將程序降溫盒中細(xì)胞放于液氮保存。
6，  要保證凍存細(xì)胞數(shù)量。
 
細(xì)胞復(fù)蘇方法
1，  從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，不斷搖動(dòng)使其融化（1分鐘左右）；
2，  盡快用培養(yǎng)液稀釋**原體積的10倍以上；
3，  低速離心10分鐘，1000轉(zhuǎn)；
4，  去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。
5，  盡快對(duì)復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行換液。
6，  擴(kuò)大培養(yǎng)后，再凍存**少?gòu)?fù)蘇數(shù)量的細(xì)胞，以保證細(xì)胞庫(kù)的完整。
 
細(xì)胞計(jì)數(shù)
1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用雙蒸水擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。
2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000
 
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備下列物品：雙蒸水 瓶子（500ml、250ml），離心管，tip頭，Eppendorf管，濾紙，餐巾紙，微量加樣器20-50µl。  具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
細(xì)胞總蛋白的提取
 利用RIPA細(xì)胞裂解液，提取經(jīng)處理細(xì)胞的總蛋白，根據(jù)RIPA試劑盒提取步驟如下：
1，收集細(xì)胞，加入300µlRIPA和3µlPMSF（不可以預(yù)先加入PMSF），利用槍頭吹打，放置于冰上30min
2，將樣品于4℃、30min、20000g離心
3，小心將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分裝成每管25µl，于－70℃保存
4，兩份5µl的細(xì)胞裂解液，稀釋10倍之后，利用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
利用BCA－100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒（購(gòu)自上海申能博采生物科技有限公司）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，步驟如下
 
1，SolutionA and SolutionB混合液（根據(jù)需要確定混和量，A：B＝50：1）
A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和加樣，如下表3－4：

	1	4	5	7
BSA（μl）	0	1.25	2.5	5
A＋B（μl）	100	98.75	97.5	95
OD570	0.005	0.063	0.123	0.243
OD570	0.003	0.067	0.128	0.245
OD570	0.006	0.065	0.120	0.248
OD570（平均值）	0.0046	0.065	0.1233	0.245
濃度（μg/ml）	0	100	250	500

 
B, 將上述加好的樣品放于酶標(biāo)板
C，將酶標(biāo)板放于37℃搖床放置30min
D，取出酶標(biāo)板，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD570
E，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖：3－1
E，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品的濃度。
F，稀釋之后樣品濃度測(cè)定值如下表3－5：

NaF濃度	0	4mM	6mM	8mM
樣品量（μl）	5	5	5	5
A＋B（μl）	95	95	95	95
OD570	0.095	0.090	0.099	0.080
OD570	0.090	0.086	0.096	0.086
OD570	0.098	0.089	0.098	0.085
OD570（平均值）	0.094	0.088	0.098	0.084
濃度（μg/ml）	179.7	167.0	188.2	158.6

 
配制SDS－PAGE膠
將垂直電泳用玻璃，先用自來水沖洗多次，之后利用蒸餾水沖洗干凈，放置于烘箱中烤干，將玻璃放置在制膠架上，根據(jù)上述PAGE膠的配置方法配制分離膠，之后將配制膠灌于兩個(gè)玻璃之間**距梳齒0.5cm或距玻板1.5cm處標(biāo)記(膠會(huì)收縮)。 加入一層異丁醇厚約1cm，置30-45min,兩者之間會(huì)出現(xiàn)一條明顯的界線，量分離膠的寬度，倒出，沖洗（1×Tris/SDS，PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，濾紙（普通）吸干（帶手套，Whatman3mm濾紙）。
加入積層膠，插梳子，置30-45min，拔梳子，沖洗（蒸餾水）未聚合的丙烯酰胺，把凝膠固定于電泳裝置，加入1×電泳緩沖液，排出凝膠底部?jī)刹０彘g的氣泡（注射器彎90℃），不要預(yù)電泳，以免破壞緩沖系統(tǒng)的不連續(xù)性。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
加樣（冰上）
加樣緩沖液用前加50µl β-巰基乙醇**950µl sample buffer（5µl-95µl，10µl-190µl，15µl-285µl，20µl-380µl），sample buffer稀釋樣品（100µg總蛋白，**少30µg）**少1：2，總體積<25µl（30-45µl），約20µl（可用水試驗(yàn)一下），100℃ 5min,沖洗加樣孔，加樣，注意加樣均勻，水沖洗槍頭于餐巾紙。**外側(cè)加等量樣品緩沖液，避免邊緣效應(yīng)，或MARK（預(yù)染蛋白質(zhì)marker）加樣孔。
電泳和取膠
正負(fù)極正確連接，80v，90-120min(1h)，電泳**溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止；關(guān)閉電源，帶手套（防止油脂阻礙蛋白轉(zhuǎn)膜）將膠取出放于一吸水紙上，備盒子，轉(zhuǎn)移液多一點(diǎn)，撬玻璃，浸濕一下，刮下**左邊的兩個(gè)加樣齒做標(biāo)記，玻璃作尺子，切積層膠，墊片挑下，轉(zhuǎn)移緩沖液，搖30min。
電轉(zhuǎn)（帶手套，油脂阻礙蛋白轉(zhuǎn)膜）
利用電轉(zhuǎn)緩沖液浸泡濾紙15min，并利用甲醛浸泡PVDF膜5min，再用電轉(zhuǎn)緩沖液浸泡PVDF膜10min，之后按照大濾紙-膜-膠-紙(試管趕氣泡)放置于電轉(zhuǎn)設(shè)置，于冰中電轉(zhuǎn)，350mA，120min，看電流，取膜，切硝酸纖維膜的右上角標(biāo)記（參考分子克隆紅皮P366）
此步之后可以利用麗春紅染液檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，并記錄蛋白Marker的位置，確定電轉(zhuǎn)效果。然后再利用蒸餾水洗滌多次，可以將麗春紅染液洗掉，繼續(xù)進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。
封閉
將膜浸于封閉液（含有5％脫脂奶粉，0.1％（v/v）的PBS－T或者TBS－T）中，在水平脫色搖床上，室溫2.5h。之后快速利用wash buffer洗滌一次15min,再洗兩次各5min。
加入一抗
shou先按要求將一抗利用PBS－T或TBS－T稀釋，將PVDF膜放于雜交袋中，按0.1ml/cm²比例加入一抗稀釋液，放于4℃冰箱過夜；之后浸于Wash buffer，按照>4ml/cm²室溫洗滌一次15min，之后利用新鮮的Wash buffer2×5min洗滌。
加入二抗
將二抗按照要求進(jìn)行稀釋于PBS－T或TBS－T中，室溫將膜浸于二抗，放于脫色搖床2.5h，之后和步驟8一樣洗滌。
染色
將kit中的solution1和solution2等體積混和，之后按照0.125/cm²等體積覆蓋于膜上（蛋白面向上，膜放于平面上），室溫放置1min，將膜利用鑷子趕走多余的detecton reagent
顯影
將膜蛋白面向上，放于X－ray Film cassette,在暗室中將film放于膜上，蓋上cassette，5分鐘。快速?zèng)_洗,之后放于第二個(gè)film，放置10min.將沖洗的膠片放于室溫涼干。
2007-09-29 | 定量PCR技術(shù)思考 

定量PCR現(xiàn)在已經(jīng)是一種常規(guī)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，俺也有相當(dāng)一段時(shí)間采用這種技術(shù)來分析基因的表達(dá)?，F(xiàn)將此技術(shù)與大家分享。
其實(shí)我認(rèn)為定量PCR**常用的是相對(duì)定量，其實(shí)和我們以前的半定量PCR一樣，只是此技術(shù)的升級(jí)版本。定量PCR**大的麻煩是特異性和污染問題。
特異性主要當(dāng)然是引物的設(shè)計(jì)，所以我主張：
shou先采用別人發(fā)表的引物為佳。當(dāng)然采用的paper的級(jí)別要高點(diǎn)為好，例如PNAS以上等，這樣的可信度高。
其次就是自己設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的原則在takara的定量PCR宣傳冊(cè)已經(jīng)非常的詳細(xì)，但是一般來說很難能夠達(dá)到完全符合要求。這樣**好設(shè)計(jì)兩對(duì)以上的引物，進(jìn)行定量PCR。定量PCR是要看溶解曲線的，而且要關(guān)心溶解曲線峰的寬度，但是這個(gè)不是很準(zhǔn)確，從嚴(yán)格的角度來說，還要在定量PCR之后，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，看是否特異。若是特異才可以采用這種方法。
再次，內(nèi)參我認(rèn)為**少應(yīng)該采用兩個(gè)，因?yàn)楝F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)很多的藥物等可以改變beta－actin的表達(dá)。
**后，做此實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要獨(dú)立重復(fù)，而不是復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
此實(shí)驗(yàn)一定要嚴(yán)格帶手套進(jìn)行，以防污染，一旦污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)便沒有意義，即使只是一點(diǎn)點(diǎn)污染。

軟瓊脂克隆法與裸鼠體內(nèi)接種法檢測(cè)細(xì)胞致瘤性的比較