Sf9培養(yǎng)要點(diǎn):
溫度:27-28攝氏度
pH:,sf9**適的pH6.2,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),Ph值會(huì)增加
傳代時(shí)間:72h(三天左右)
細(xì)胞來(lái)源:Sf9(貨號(hào)B825-01)和Sf21(貨號(hào)B821-01)細(xì)胞系是傳統(tǒng)的用于桿狀病毒表達(dá)的細(xì)胞系,源于美G農(nóng)業(yè)部昆蟲(chóng)病理實(shí)驗(yàn)室。此細(xì)胞系適用于InsectSelect系統(tǒng)。這兩株細(xì)胞衍生于IPLBSF-21細(xì)胞系,來(lái)源于秋蠅蠕蟲(chóng)(草地夜蛾)蛹的卵巢組織。(以上來(lái)自invitrogen)
細(xì)胞特點(diǎn):規(guī)則的帶有顆粒球形。貼壁緊。
標(biāo)準(zhǔn)條件的定義:
培養(yǎng)**低密度:0.6/ml(健康對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞活率**少應(yīng)不低于90%?;盥实陀?0%細(xì)胞不是在**佳條件下培養(yǎng)不能用于實(shí)驗(yàn))1×/mL將出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)
傳代培養(yǎng):傳代培養(yǎng)需將細(xì)胞調(diào)整到維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)和**大活率。
貼壁培養(yǎng): 貼壁細(xì)胞傳代需在細(xì)胞長(zhǎng)成單層(如下定義)然后1:5(細(xì)胞體積:**后培養(yǎng)基體積)稀釋維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。形成單層細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)
懸浮培養(yǎng):在細(xì)胞密度達(dá)到2.0×-2.5×細(xì)胞/mL后將密度調(diào)整**0.7×-1.0×細(xì)胞/mL進(jìn)行懸浮傳代。確保傳代細(xì)胞密度不高于4×個(gè)/mL或保持密度高于1×個(gè)/mL以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。
Sf9懸浮培養(yǎng)所需要的細(xì)胞數(shù)
培養(yǎng)基:sf-900 Ⅲ SFM(添加2%的血清減小感染過(guò)程中蛋白水解量)
培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)體積:
凍存:一旦細(xì)胞系建立且倍增規(guī)律則可以進(jìn)行凍存。細(xì)胞需達(dá)到90%活率和80-90%融合的要求(如:低代次)推薦凍存幾管。當(dāng)融解細(xì)胞,它將會(huì)達(dá)到**佳使用狀態(tài)。
1. 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。需要足夠的如上表所示密度的細(xì)胞凍存2-4管。細(xì)胞可是懸浮或貼壁培養(yǎng);
2. 將無(wú)菌凍存管立于冰上,做好標(biāo)記;
3. 室溫400-600×g離心10min。移除上清。
4. 以給定的密度在凍存液中重懸細(xì)胞;
5. 移取1mL細(xì)胞懸液置于無(wú)菌凍存管中;
6. 置于-20℃1h,然后移**-80℃24-48h;
7. 儲(chǔ)存于液氮中。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞:需要的是對(duì)數(shù)期的細(xì)胞>95%發(fā)育能力,可以完成成功的轉(zhuǎn)染。
載氧:對(duì)于**優(yōu)生長(zhǎng)條件和蛋白的表達(dá),昆蟲(chóng)細(xì)胞要求被動(dòng)的通氧。積極的通氧系統(tǒng)要求溶氧飽和在10%-50%
Sf900II和sf900Ⅲ的區(qū)別:一般推薦Sf900II來(lái)大量表達(dá)蛋白
Sf900II含有表面活性劑(剪切力保護(hù)劑(保護(hù)細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)時(shí)不會(huì)受到剪切力傷害))
當(dāng)設(shè)計(jì)純化多聚組氨酸標(biāo)簽蛋白的計(jì)劃時(shí),注意
無(wú)血清培養(yǎng)基不能直接用于螯合樹(shù)脂,因?yàn)榕囵B(yǎng)基的成分會(huì)除去樹(shù)脂中的鎳離子。
細(xì)胞培養(yǎng)的一般順序:復(fù)蘇——傳代——傳代穩(wěn)定——凍存
應(yīng)當(dāng)遵循的一般過(guò)程:復(fù)蘇——貼壁培養(yǎng)——懸浮——懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)(產(chǎn)生目標(biāo)蛋白)
(也可不經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng),直接懸浮培養(yǎng))
貼壁時(shí)間:45min
懸浮的轉(zhuǎn)速:80rpm
附:離心機(jī)rcf與g的換算:
無(wú)血清培養(yǎng)基可以選擇性加入一定的抑菌劑防止細(xì)菌或者真菌污染:
培養(yǎng)基:GIBCO-SFM900
加青霉素鏈霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)兩性霉素B抑制真菌生長(zhǎng)