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另外一個(gè)不容易解釋的邊緣效應(yīng)是，在周邊孔中的細(xì)胞會(huì)集中在孔的外側(cè)，如下圖所示（孔內(nèi)白亮的為細(xì)胞集中的區(qū)域）。這種現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)中常用的96孔板中十分明顯。由于大多細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受周圍接觸細(xì)胞的抑制，所以這種邊緣效應(yīng)導(dǎo)致邊緣孔內(nèi)細(xì)胞平均生長(zhǎng)速度要比其他孔來(lái)得慢，從而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中引入系統(tǒng)誤差。這種邊緣效應(yīng)是由于在室溫下的培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱后，培養(yǎng)板上產(chǎn)生的溫度差影響細(xì)胞沉降引起的。所以這種解決邊緣效應(yīng)的一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法，就是在培養(yǎng)板內(nèi)分入細(xì)胞后，在室溫下放置1-2個(gè)小時(shí)，讓細(xì)胞在沒(méi)有溫度差的情況下沉降并貼附，然后再轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱內(nèi)[1]。該方法**少適合CHO等在室溫下能貼壁的細(xì)胞。 [1]BETINA KERSTIN LUNDHOLT, KURT M. SCUDDER, and LEN PAGLIARO, A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays. Journal of Biomolecular Screening 2003:566-570 10、細(xì)胞培養(yǎng)液簡(jiǎn)介 雖然細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)早在19世紀(jì)末就開始了，但用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液主要是動(dòng)物的血清或淋巴液。被人稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父的Ross Harrison就是利用青蛙的淋巴液來(lái)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的。這樣的培養(yǎng)液不但性質(zhì)不穩(wěn)定，而且只能進(jìn)行非常小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。 **個(gè)人工配制的培養(yǎng)液是由Lewis & Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成的。但是人們對(duì)于培養(yǎng)液中的化學(xué)成分并不清楚。直到1948年，F(xiàn)isher才研制成了**個(gè)化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006。 實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素等。為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)液中一般有一個(gè)pH緩沖系統(tǒng)，同時(shí)常加入少量的酚紅作為pH指示劑。另外培養(yǎng)液中一般需要加入一定量的血清。 培養(yǎng)液中的氨基酸除了13種細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的氨基酸外，往往加入一些非必需的氨基酸以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。在必需的氨基酸中，L-谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定（在4℃培養(yǎng)溶液中半衰期為3個(gè)星期，37℃中為1個(gè)星期），需要在使用時(shí)加入。 葡萄糖在培養(yǎng)液中的含量一般為1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。它是細(xì)胞代謝重要的能量來(lái)源。 細(xì)胞培養(yǎng)液中都有一個(gè)平衡鹽系統(tǒng)，用于維持細(xì)胞的滲透壓、維持pH和細(xì)胞正常的代謝等。**常用的平衡鹽系統(tǒng)有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS); Earle's balanced salts (EBSS) 和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它們都含有細(xì)胞所必需的5種離子：鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子和磷酸根。培養(yǎng)液中的pH緩沖系統(tǒng)一般是碳酸氫鈉和HEPES等。 培養(yǎng)液中的維生素包括葉酸、維生素B、煙酰胺和吡哆醇等。培養(yǎng)液中的微量元素元素包括Cu2+ ，Zn2+ ，和Mn2+等。 血清中含有生長(zhǎng)因子、促進(jìn)細(xì)胞帖壁的因子、礦物質(zhì)、激素、脂類等，另外血清可以抑制胰酶的活性。 一般培養(yǎng)液都含酚紅作為pH指示劑，它是細(xì)胞培養(yǎng)液狀態(tài)的一個(gè)很好的標(biāo)志。過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)或者微生物的污染都會(huì)使培養(yǎng)液的pH發(fā)生改變。需要注意的是，酚紅可以模擬類固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)雌性激素敏感（比如實(shí)驗(yàn)本身就是研究雌性激素對(duì)細(xì)胞的作用），就應(yīng)當(dāng)使用沒(méi)有酚紅的培養(yǎng)液。 11、選用血清時(shí)要注意什么？ 細(xì)胞培養(yǎng)使用的一般是胎牛血清。由于胎牛血清價(jià)格非常貴，為了節(jié)約，對(duì)于一些比較容易生長(zhǎng)的細(xì)胞，有時(shí)候也使用新生牛血清，或者馬血清。 血清中含有血清清蛋白、生長(zhǎng)因子等。對(duì)于大多數(shù)培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞而言，培養(yǎng)液中加入血清是生長(zhǎng)必須的。雖然無(wú)血清培養(yǎng)液已經(jīng)出現(xiàn)，但無(wú)血清培養(yǎng)液只適用于特定的細(xì)胞，而且價(jià)格一般比較昂貴，所以在比較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)仍然需要血清。 對(duì)于一種特定的細(xì)胞，可以從ATCC（American Type Culture Collection）查到培養(yǎng)液中需要加入的血清的種類和濃度。 來(lái)自不同商家的血清差異很大，即使來(lái)自同一商家的血清，不同批次之間仍然會(huì)有非常大的差異。對(duì)于培養(yǎng)不易生長(zhǎng)的細(xì)胞而言，挑選優(yōu)質(zhì)的血清非常重要。一般來(lái)說(shuō)，可以向血清生產(chǎn)商家索取少量不同批次的血清，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)后找到對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)**有利的批次，然后大量購(gòu)買該批次的血清，儲(chǔ)存于-80度的冰箱內(nèi)，供長(zhǎng)期使用。 |
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12、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中有哪些污染？ 細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。 化學(xué)污染 化學(xué)污染是一些對(duì)細(xì)胞有毒性的或?qū)?xì)胞產(chǎn)生刺激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來(lái)自于沒(méi)有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。 化學(xué)污染中比較引人注意的是細(xì)菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的疏水性的細(xì)胞壁組成物質(zhì)，對(duì)塑料等疏水性強(qiáng)的物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力。細(xì)菌內(nèi)毒素可刺激部分細(xì)胞產(chǎn)生一些激素或細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上的**主要的熱原（即注射到動(dòng)物體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)熱），所以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細(xì)胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過(guò)程中更是要避免細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。 生物污染 生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細(xì)胞的污染。 細(xì)菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非?？焖俚纳L(zhǎng)。這些污染比較容易觀察到，它們往往會(huì)使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過(guò)顯微鏡觀察就可以看見。 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因?yàn)椴《绢w粒特別微小，一般的實(shí)驗(yàn)室都沒(méi)能力檢查細(xì)胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對(duì)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會(huì)使研究人員長(zhǎng)期得到受病毒影響的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1956 年 Robinson 及其同事**發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初的一個(gè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在美G培養(yǎng)的細(xì)胞中，**少有15%被支原體污染 。由于支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，在細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時(shí)對(duì)常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 培養(yǎng)多種細(xì)胞時(shí)操作不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的交叉污染。由于不同細(xì)胞的生產(chǎn)速率不同，污染的生長(zhǎng)速率快的細(xì)胞**終會(huì)完全取代被污染的細(xì)胞。 13、怎么樣才能減少污染的機(jī)會(huì)？ 減少化學(xué)污染 對(duì)于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機(jī)會(huì)。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，**好是經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試的。 另外盡量使用一次性的細(xì)胞培養(yǎng)器皿。由于標(biāo)準(zhǔn)廠家一次性細(xì)胞培養(yǎng)器皿的生產(chǎn)環(huán)境比較嚴(yán)格，得到的產(chǎn)品潔凈度很高，從而減少了由細(xì)胞培養(yǎng)器皿帶入污染的機(jī)會(huì)。 減少生物污染 由于一般的污染發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)的操作過(guò)程中，所以良好的細(xì)胞培養(yǎng)操作環(huán)境和操作習(xí)慣是減少生物污染的關(guān)鍵。 要用一個(gè)專門的房間用于細(xì)胞培養(yǎng)，注意保持房間的清潔。 要有一個(gè)定期檢驗(yàn)的合格的超凈臺(tái)（超凈臺(tái)內(nèi)的潔凈度應(yīng)該為100級(jí)，與計(jì)算機(jī)硬盤的生產(chǎn)環(huán)境相當(dāng)）。在使用超凈臺(tái)前開啟通風(fēng)裝置并打開紫外燈滅菌30分鐘。操作時(shí)要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺(tái)的非無(wú)菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養(yǎng)液的瓶子要加入漂白粉或漂白液，以避免微生物的生長(zhǎng)。每次實(shí)驗(yàn)完后，要向通向廢培養(yǎng)液瓶的塑料管內(nèi)噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺(tái)面（只用70%酒精擦拭會(huì)導(dǎo)致灑落在臺(tái)面的培養(yǎng)液在臺(tái)面上形成難以清除的污垢）。 不要在超凈臺(tái)里使用酒精燈等燈具，因?yàn)檫@樣會(huì)因燈的熱的火焰引起的空氣對(duì)流而破壞超凈臺(tái)里本來(lái)規(guī)則的空氣層流，使本來(lái)存在于超凈臺(tái)底層的微粒被帶到上層，帶來(lái)更多的污染機(jī)會(huì)。 加熱培養(yǎng)液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長(zhǎng)，從而成為一個(gè)重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的用于保持濕度的水盤也需要定期清洗。 為了減少不同細(xì)胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養(yǎng)液或胰酶培養(yǎng)不同的細(xì)胞；不要在一個(gè)超凈臺(tái)上同時(shí)進(jìn)行多種細(xì)胞的操作。 分裝每次小量使用的溶液（如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液），以減少多次使用時(shí)污染的機(jī)會(huì)。以防萬(wàn)一 即使再小心，污染難免還是會(huì)發(fā)生。所以得到一個(gè)新的細(xì)胞株后的**件事情，是把細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)增后凍存起來(lái)，以備不測(cè)。 何況一般的細(xì)胞在傳代次數(shù)多了以后，遺傳特性也會(huì)發(fā)生改變。通過(guò)批量?jī)龃娴霓k法，可以有效的把培養(yǎng)的細(xì)胞控制在一定的代數(shù)以內(nèi)。 14、內(nèi)毒素是什么？ 內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組分之一。一個(gè)活的細(xì)菌很少釋放內(nèi)毒素，但死后可放出大量?jī)?nèi)毒素。 內(nèi)毒素在血液中存在時(shí)會(huì)引起動(dòng)物發(fā)熱，是醫(yī)療注射液中**主要的熱原。19 世紀(jì) 40 年代開始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)熱原（主要是細(xì)菌內(nèi)毒素）。 后來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)鱟（一種海洋生物）血液遇到極微量的內(nèi)毒素會(huì)發(fā)生凝血反應(yīng)，從而在19 世紀(jì) 70 年代**了鱟試劑用于快速精確檢測(cè)內(nèi)毒素。內(nèi)毒素含量一般用G際單位（ EU ）來(lái)衡量，一般來(lái)說(shuō) 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。 由于內(nèi)毒素會(huì)對(duì)很多種細(xì)胞產(chǎn)生刺激，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在實(shí)驗(yàn)中要盡量減少在培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素的來(lái)源。 由于生產(chǎn)工藝的提高，來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)廠家的血清和培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素含量很少。所以現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來(lái)源主要是水、添加劑、細(xì)胞培養(yǎng)器皿等。傳統(tǒng)的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過(guò)離子交換柱、活性炭柱和超濾三個(gè)環(huán)節(jié)的純水制備儀制備的超純水都能滿足細(xì)胞培養(yǎng)用水的要求。盛水器具上的細(xì)菌內(nèi)毒素可能給超純水帶來(lái)污染。長(zhǎng)時(shí)間放置的超純水也可因盛水器具上細(xì)菌生長(zhǎng)而污染細(xì)菌內(nèi)毒素。 內(nèi)毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實(shí)驗(yàn)室里用普通的方法不能完全的消除除內(nèi)毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時(shí)干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內(nèi)毒素。 一次性塑料器皿經(jīng)過(guò)高溫注塑成型，沒(méi)有內(nèi)毒素存在。但在處理、包裝等生產(chǎn)過(guò)程中，可能污染內(nèi)毒素。杭州生友生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等在萬(wàn)級(jí)無(wú)塵車間生產(chǎn)和包裝，產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量低于 0.5EU/ml。 15、細(xì)胞的凍存 一個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)新的細(xì)胞株后，shou先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來(lái)。細(xì)胞凍存shou先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時(shí)有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過(guò)程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。 細(xì)胞冷凍過(guò)程有四個(gè)要點(diǎn)：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲(chǔ)存環(huán)境。 細(xì)胞的收獲 用來(lái)凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時(shí)候，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時(shí)換一次培養(yǎng)液。收獲用來(lái)凍存的細(xì)胞開始時(shí)方法和平時(shí)一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的**終細(xì)胞濃度的二倍（一般是 400-1000 萬(wàn) 細(xì)胞 /ml ），加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。 保護(hù)劑的使用 細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的**終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對(duì)特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時(shí)使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會(huì)好些。保護(hù)劑在使用時(shí)先用培養(yǎng)液或血清配成**終濃度的 2 倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。 細(xì)胞凍存的速率 細(xì)胞的冷凍速率**是控制在讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過(guò)度脫水導(dǎo)細(xì)胞損害。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，每分鐘降 1 ** 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個(gè)小時(shí)，再放入 -80℃冰箱過(guò)夜（如果沒(méi)有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長(zhǎng)期保存。 另外一個(gè)辦法是，在-20℃1-2個(gè)小時(shí)以后，把冷凍管懸掉在液氮罐的氣相中，以控制冷卻的速率。這個(gè)方法比較簡(jiǎn)單，因?yàn)榧?xì)胞也可以在液氮罐的氣態(tài)中長(zhǎng)期保留，所以不用計(jì)時(shí)。對(duì)于沒(méi)有-80℃冰箱，或者購(gòu)買干冰不方便的人來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)比較好的辦法。 儲(chǔ)存環(huán)境 細(xì)胞長(zhǎng)期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃** -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能**好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時(shí)引起爆炸（但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲(chǔ)少量液氮，需要經(jīng)常添加）。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。 16、怎樣化凍動(dòng)物細(xì)胞？ 化凍過(guò)程的原則是要讓凍存的細(xì)胞快速融化。 如果細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮液面下，使用者**好準(zhǔn)備好必要的防護(hù)器具（**少要戴上護(hù)目鏡，**好戴上面罩和較厚的手套），防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害(筆者曾經(jīng)在化凍的時(shí)候，為了防止污染，把冷凍管放到一個(gè)15ml離心管中，而且把蓋子擰上了，打算放到 37℃水浴，恰好回過(guò)頭去和別人談話，忽然聽到一聲爆炸聲，回頭一看，15ml的離心管就剩下蓋子了，其他的都爆飛了)。從冰箱或液氮罐取出細(xì)胞后將凍存管放 37℃水浴輕輕晃動(dòng)使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。 由于大多防凍劑與細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間接觸時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒害，所以**好盡快除去細(xì)胞凍存時(shí)加入的防凍劑。 防凍劑的去除方式和細(xì)胞的敏感性有關(guān)。有些細(xì)胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長(zhǎng)，可以直接將化凍的凍存細(xì)胞連同其凍存液加入預(yù)備好 15-20ml 培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后換培養(yǎng)液。 對(duì)于敏感細(xì)胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。 |
